Протеазы (пептид-гидролазы)

Протеолитичеекне ферменты катализируют гидролитическое расщепление белковых веществ до пептидов и гидролиз этих продуктов до аминокислот.

Протеазы делят на две группы: протеиназы и пептидазы. Первые из них расщепляют настоящие белки, а вторые катализируют распад полипептидов и дипептидов до аминокислот. Однако такое деление довольно условно.

При определении активности протеаз в почве в качестве субстрата обычно применяют казеин, желатину и некоторые пептиды. Активность протеаз учитывают по количеству аминокислот или других кислоторастворимых продуктов, освобождающихся при распаде белковых субстратов в почве, либо по изменению физических свойств субстрата, например но уменьшению вязкости.

Колориметрические методы основаны на учете количества аминокислот, образующихся при протеолизе внесенных в почву белков, путем связывания их в окрашенные комплексы.

Метод А.Ш. Галстяна [1978]

Ход анализа. 1 г почвы помещают в стеклянную колбу емкостью 50 мл, прибавляют 5 мл 1-процентного раствора желатины или казеина, приготовленного на фосфатном буфере (рН 7,4), и 0,2 мл толуола. Колбу тщательно встряхивают, закрывают корковой пробкой и ставят в термостат на 24 ч при температуре 30 0С, периодически встряхивают. После инкубации добавляют 5 мл воды и содержимое колбы фильтруют. Из фильтрата берут 5 мл раствора в пробирку, прибавляют 0,5 мл 0,1 н. серной кислоты и 3 мл 20-процентного сернокислого натрия для осаждения белков. Затем снова фильтруют в пробирку и добавляют 1 мл 2-процентного раствора нингидрина. Смесь тщательно взбалтывают и нагревают на кипящей водяной бане в течение 10 мин. Полученный окрашенный раствор из пробирки переливают в мерную колбу объемом 50 мл, объем доводят дистиллированной водой до метки и проводят фотоколориметрирование, используя зеленый светофильтр (длина волны 500-560 нм). Контрольные пробы ставят со стерилизованной сухим жаром почвой и субстратом без почвы. Количество аминокислот в переводе на глицин находят по калибровочной шкале, составленной на чистый глицин.

Активность протеазы выражают в миллиграммах глицина на 1 г почвы за 24 ч.

Реактивы:

1) 1-процентный раствор желатины или казеина в фосфатном буфере (рН 7,4) - при биодиагностике используют водный раствор;

2) толуол;

3) фосфатный буфер (рН 7,4);

4) 0,1 н. Н2SO4;

8) 2-процентный раствор нингидрина: 2 г нингидрина растворяют в 100 мл ацетона. Рабочий раствор готовят, смешивая 95 мл ацетонового раствора с 1 мл СН3СООН и 4 мл воды. Поскольку раствор нестойкий, готовят его только перед употреблением;

7) стандартный раствор глицина: водный раствор глицина концентрации 100 мкг в 1 мл. Путем соответствующих разбавлений готовят рабочие растворы, окрашивают нингидрином (как описано выше) и составляют шкалу.

Интересное из раздела

Биоиндикационные методы определения занрязнений водоемов по комплексу беспозвоночных
Определение качества поверхностных вод, которое осуществляется главным образом с помощью методов физико-химического анализа, представляет одну из сложнейших проблем экологического мониторин ...

Платность за пользования природными ресурсами
Природопользование как сфера знания включает в себя элементы естественных, общественных и технических наук (в том числе охрану природы с ее разделами - охраной атмосферы, вод, ресурсоведени ...

Экологические проблемы современности
Одна из характерных особенностей современного мира - обострение глобальных проблем, которые по своему характеру выходят за рамки интересов различных классов и общественных систем, и от реше ...