Изменение генов

Объединение разных метаболических путей в од­ном микроорганизме с помощью конъюгации - это лишь один из способов создания бактерий с новыми свойствами. Расширить их катаболические возможности можно и другим путем, моди­фицируя гены, кодирующие ферменты того или иного метаболического пути. Осуществимость этого подхода проверяли на примере плазмиды pWWO, 12 генов которой кодируют мета-рас­щепление толуола и ксилола. Обладающие этой плазмидой псевдомонады могут использовать в качестве источника углерода алкилбензоаты [5].

Детальный биохимический и генети­ческий анализ показал, что несущие pWWO-плазмиду бактерии могут расщеплять 4-этил­бензоат только до 4-этилкатсхола, который инактивирует один из основных ферментов дан­ного метаболического пути, катехол-2,3-диоксигеназу, являющуюся продуктом гена xylE, и поэтому не разрушается и накапливается в сре­де. Кроме того, 4-этилбензоат, в

отличие от ос­тальных алкилбензоатов, не активирует XylS-белок; поэтому, если он является единственным субстратом, хуl-оперон не транскрибируется. Для усовершенствования природной системы летиорасщепления алкилбензоатов необходимо решить две основные задачи:

1)

предотвратить инактивацию катеход-2,3-диоксигеназы 4-этил-бензоатом;

2) индуцировать транскрипцию ге­нов хуl -оперона в том случае, если единственным субстратом является 4-этилбензоат[5].

Для решения второй задачи был проведен поиск мутантной плазмиды. Для этого в плазмиду, несущую ген устойчивости к

ампициллину, встроили ген устойчивости к

тетрациклину, на­ходящийся под контролем Рт-промотора. В дру­гую плазмиду, несущую ген устойчивости к канамицину, встроили ген xylS. Полученными конструкциями трансформировали E. coli, ото­брали клетки, содержащие обе плазмиды, по признаку устойчивости к ампициллину и канамицину (рис. 8, А), обработали их мутагеном этилметансульфонатом и вырастили на среде, содержащей тетрациклин и 4-этилбензоат. Рас­тущие на этой среде клетки содержат мутантный ген xylS и продуцируют измененный XylS-белок (S*), который способен взаимодействовать с 4-

этилбензоатом и активировать транскрипцию гена устойчивости к тетрациклину. Чтобы ре­шить проблему инактивации катехол - 2,3 -диоксигеназы, мутантный ген xylS встроили в плаз­миду с широким кругом хозяев, несущую ген

устойчивости к

канамицину, и ввели ее в клет­ки P. putida, содержащие плазмиду pWWO (рис. 8, Б). Трансформированные клетки вы­сеяли с высокой плотностью на чашки с мини­мальной средой, содержащей 4-этилбензоат в качестве единственного источника углерода, канамицин для отбора клеток с плазмидой и

этилметансульфонат. Клетки, растущие на этой среде, вырабатывают измененную катехол-2,3-диоксигеназу, которая не ингибируется 4-этил-катехолом. Дополнительный анализ подтвердил, что в гене катехол-2,3-диоксигеназы pWWO действительно произошла мутация и что два мутантных гена обеспечивают расщепление 4-этилбензоата [5].

Оба модифицированных гена участвуют в процессе деградации всех субстратов данного метаболического пути. Поэтому стратегия, использованная для повышения эффективности расщепления 4-этилбензоата, применима и в случае других соединений. Таким образом, проведенная работа показывает, что вполне реально усовершенствование того или иного катаболического пути с помощью технологии рекомбинантных ДНК, традиционного мутагенеза и соответствующих методов отбора [5].

Рис.8, А. Создание системы синтеза белка XylS-белка, активируемого 4-этилбензоатом

Рис.8, Б. Создание системы синтеза модифицированной катехол-2,3-дикосигеназы, которая не ингибируется 4-этилкатехолом

Интересное из раздела

Расчет прогноза уровня загрязнения водного объекта фенолы
Определить водный объект, в который поступают сточные воды с повышенным содержанием (указать ингредиент). Определить источник загрязнения. Привести гидрологические параметры, необх ...

Экологическое состояние Челябинской области
В условиях глобальных изменений окружающей среды особую актуальность приобретают вопросы развития теории эколого-геохимической устойчивости почв, которая является важной составной частью те ...

Механизмы компенсации экологического ущерба
Мы не допустим, однако, чтобы глаза хоть слегка ошибались. Не будем, поэтому винить их в том, в чем повинен разум. Лукреций. О природе вещей, гл. IV Экологический ущерб – это и ...