Основные требования, предъявляемые к методам определения активности ферментов в почве

Концентрацию субстрата выбирают с таким расчетом, чтобы скорость ферментативной реакции была постоянной в течение всего периода экспозиции и количество молекул субстрата хватило для насыщения всех молекул ферментов, содержащихся в данной навеске почвы, до конца реакции. Для этого требуют некоторый избыток субстрата. Однако большой избыток субстрата снижает скорость реакции.

Оптимальная концентрация субстрата устанавливается опытным путем для определенных величин навески почвы. Иногда произвольно берут разные навески почвы и концентрации субстратов, что является недопустимым. Для получения сопоставимых данных условия должны быть стандартизированы. В первую очередь необходимо установить минимальную величину навески почвы, в которой с достаточной точностью можно обнаружить активность изучаемого фермента, и соответственно этой навеске определить оптимальную величину концентрации субстрата.

Существенным требованием к субстратам является их хорошая растворимость. Нерастворимые или слаборастворимые субстраты трудно вступают во взаимодействие с ферментами.

Реакция среды и буферные растворы.

Скорость ферментативных реакций зависит от значений рН среды. Максимальная активность ферментов проявляется лишь в узком интервале значений рН, которые называют оптимум рН действия данного фермента. Как уменьшение, так и увеличение рН приводит к снижению активности ферментов (рис. 3). Поддержание оптимального и постоянного значений рН в реакционной среде на протяжении опыта при определении ферментативной активности является одним из важных методологических условий. Опытным путем устанавливается значение оптимума рН ферментов. При этом следует учесть, что почвы с различными значениями рН неодинаково влияют на сдвиг рН буферного раствора. Это зависит от буферности самой почвы, существенные сдвиги могут быть в малобуферных кислых и щелочных почвах. При определении оптимумов рН ферментов почвы после прибавления реакционной смеси к почве значение рН суспензии доводится до соответствующей величины значения буферного раствора потенциометрическим титрованием.

При определении ферментативной активности для обеспечения заданной рН используют буферные растворы с величиной рН, соответствующей оптимуму действия данного фермента. Предлагается также определять ферментативную активность почвы при рН почвы, так как почва - сама буферная система. Однако это зависит от цели определения активности фермента. При решении прикладных задач по ферментативной диагностике почв предпочтительно определять активность почвы при почвенном значении рН, а при исследовании чисто фундаментальных почвенно – энзимологических вопросов рН среды должен быть оптимальным для данного фермента.

Рис.3. Влияние рН среды на активность ферментов

Важное значение имеет катионно – анионный состав буферного раствора: различные катионы и анионы оказывают неодинаковое влияние на отдельные ферменты и на почвы. Так, фосфат-ионы будут ингибировать фосфатазу, если используется фосфатный буфер при определении фосфатазной активности почвы; ионы аммония могут ингибировать уреазу, если использовать аммиачный буферный раствор. Лимонно-кислые ионы буферных растворов будут связываться с ионами железа, если их много в почве. Другим важным требованием к буферным растворам является, чтобы они не растворяли и экстрагировали из почвы окрашенное органическое вещество, что будет мешать при последующем спектрофотометрическом и титрометрическом анализе продуктов ферментативной реакции. Поэтому экспериментально подбирают необходимый состав буферного раствора для каждого вида фермента и с учетом свойств почвы.

Температура инкубации.

Скорость ферментативных реакций зависит от температуры. По мере повышения температуры до определенного значения скорость реакции возрастает, при высоких температурах ферменты денатурируют и теряют свою активность. Низкие температуры снижают ферментативную активность. Максимальную активность ферментов в почве обнаруживают в пределах температур от 45 до 600С (рис.4). Однако активность почвенных ферментов не определяют при оптимальных значениях температуры, так как они сильно отличаются от естественной температуры почвы за вегетативный период. Кроме того, в результате относительной деятельности сроков инкубации (от нескольких часов до нескольких суток) при таких температурных условиях может происходить некоторая термическая инактивация ферментов и разложение некоторых субстратов. Определение активности почвенных ферментов обычно производят при температуре 30 – 500С. Однако, согласно рекомендациям Международного союза по номенклатуре и классификации ферментов, необходимо придерживаться стандартной температуры 30 0С.

Интересное из раздела

Фитоиндикация лесных фитоцинозов по состоянию сосны обыкновенной
Роль атмосферы в природных процессах огромна. Наличие вокруг земного шара атмосферы определяет общий тепловой режим поверхности нашей планеты, защищает ее от вредных космического и ультрафио ...

Приливы и отливы
Приливы и отливы это периодические колебания уровня воды (подъемы и спады) в акваториях на Земле, которые обусловлены гравитационным притяжением Луны и Солнца, действующим на вращающуюся Землю. Вс ...

Загрязнение мирового океана
Вода занимает особое положение среди природных богатств Земли. Водная среда, которая включает поверхностные и подземные воды называется гидросферой. Поверхностные воды в основном сосредото ...