Основные требования, предъявляемые к методам определения активности ферментов в почве

2. Контроль на почвенные вещества, учитываемые вместе с продуктами ферментативной реакции (контроль без субстрата -К.б.с). Нестерильную почву обрабатывают толуолом, вносят буферный раствор и соответствующий объём воды вместо субстрата. Дальнейшие операции аналогичны опытным процедурам.

3. Контроль на чистоту реактивов и субстрата и на спонтанный распад субстрата (контроль без почвы К.б.п) В реакционные сосуды наливают указанные в соответствующей методике количества субстрата, буфера и антисептика и эту контрольную смесь обрабатывают как опытную. Достаточно поставить один контроль для данной серии реактивов и субстрата.

При определении активности гидролитических ферментов можно ограничиваться постановкой контроля без субстрата и контроля без почвы, так как известно, что неферментативный гидролиз органических соединений в почве незначителен и за короткий срок инкубации при определении ферментативной активности почвы не может вносить существенной коррективы на результаты опыта. Кроме того, проведение этого контроля довольно хлопотно. Однако предварительно следует убедиться в том, что неферментативный гидролиз субстрата в почве не происходит, особенно в случае содержания в почве значительных количеств различных техногенных химических ингредиентов (загрязнителей), для чего ставят несколько контролей без фермента. При определении активности окислительно-восстановительных ферментов достаточен контроль без фермента, так как он включает в себя контроль без субстрата и контроль без почвы. При расчете ферментативной активности почвы (ФАП) сумму показателей контрольных проб вычитают из показателя опытных вариантов (ПР - продукт реакции), разница соответствует количеству продукта, образовавшегося в результате ферментативного превращения субстрата ФАП = ∑ ПР - ∑ К.б.ф., К.б.с, К.б.п. При пересчёте на единицу веса почвы (на 1 г, 100 г и т.д.) продукт фер­ментативной реакции характеризует ферментативную активность почвы.

Единицы измерения активности ферментов в почве.

Активность фермента выражают в единицах ферментативного действия, что представляет собой изменения, производимые ферментом в субстрате в определённый отрезок времени при строго определённых условиях: концентрации субстрата, рН, температуре и т.д. Как методы определения активности ферментов, так и выражение результатов измерений активности весьма разнообразны. Для отдельных ферментов предложены крайне различные и произвольные единицы. Например, ферментативную активность выражают в физических изменениях субстрата (изменение вязкости, поляризации, оптической плотности), количествах продуктов реакции, количествах превращенной или остаточной части субстрата, ферментных или энергетических единицах и т.д. Отсутствие стандартных единиц измерения активности ферментов не даёт возможности сопоставить результаты даже при применении единых методов.

Наряду с разработкой стандартных условий определения активности ферментов в почве необходимо стандартизировать и способы выражения величин скорости ферментативных реакций. По-видимому, в настоящее время целесообразно сохранить наиболее широко используемую единицу измерения - количество продуктов ферментативного превращения субстрата (мкг, мг, мл, см3, мкМ и др.) на единицу веса почвы за единицу времени при 30 °С. В то же время, в соответствии с рекомендацией Международного биохимического союза по ферментам (Номенклатура ферментов, 1979) за единицу измерения принята стандартная ферментная единица (ФЕ). 1 ФЕ соответствует такому количеству фермента, которое при заданных условиях катализирует превращение 1 мкМ субстрата в 1 мин. В условиях почвенных ферментов это количество может быть рассчитано на единицу веса почвы (например, на 1 г почвы). Однако в почвенно-энзимологических исследованиях в связи с большой гетерогенностью по составу и состоянию ферментов в почве и незначительной их активности в отличие от чистых ферментных препаратов трудно производить перерасчёты на ферментные единицы. В почве определяется не активность конкретной ферментативной молекулы, а ферментативную активность почвы, т.е. проявление некоторой каталитической функции содержащихся в различном состоянии в почвенной массе ферментов (свободных, внеклеточных, внутриклеточных, иммобилизованных, связанных с клеточными фрагментами). В ферментных единицах может быть выражена активность ферментсодержащих препаратов, получаемых экстракцией из почвы. Это фундаментальное направление в почвенной энзимологии в настоящее время получает своё развитие.[25]

Интересное из раздела

Проблемы Арала и сохранение его
Аральское море являлось четвёртым по величине озером в мире, не имеющим выхода в мировой океан. За его размеры (площадь Арала составляла 64-68 тыс. кв. километров) назвали морем. О проблеме ...

Эксплуатация биологических ресурсов
Биоресурсы – понятие не то чтобы незнакомое, но не вполне привычное. Чаще всего словосочетание «природные ресурсы» ассоциируется с минеральным сырьём, хотя что такое леса, луга или рыба зна ...

Разрушение озонового слоя
Озон, находящийся на высоте около 25 км от земной поверхности, пребывает в состоянии динамического равновесия. Он представляет собой слой повышенной концентрации толщиной около 3 мм. Страт ...