Основные требования, предъявляемые к методам определения активности ферментов в почве

Рис.4. Влияние температуры на активность нуклеазы в почве (выщелоченный чернозем)

Продолжительность инкубации.

Ферментативную активность почвы необходимо определять при начальной скорости реакции и сохранять ее постоянной в течение всего времени экспозиции (рис.5). Скорость ферментативной реакции во времени может падать в результате следующих причин:

1. уменьшения концентрации субстрата ниже насыщающей концентрации, поскольку он расходуется в процессе реакции, а также может адсорбироваться почвой;

2. частичного разрушения самих ферментов во время реакции;

3. влияния образующихся продуктов реакции, особенно на ферменты при длительных сроках.

Рис.5. Изменение скорости фосфатазной реакции в почве (дерново-подзолистая почва)

При этом возможны два типа влияния: специфическое торможение активности ферментов продуктами реакции и обратимость ферментативных реакций, так как по закону действующих масс скорость обратимых реакций пропорциональна произведению концентраций реагирующих веществ.

В связи с относительной низкой активностью фермента в почве время компостирования почв с субстратом продолжительное – от нескольких часов до нескольких суток. Необходимо время инкубации сократить до минимума, чтобы исключить отрицательный эффект вышеуказанных факторов и возможность роста колоний некоторых видов микроорганизмов.

Перемешивание реакционной смеси в процессе инкубации.Ферменты в почве находятся преимущественно в адсорбированном или ином связанном состоянии почвенными коллоидами. Постоянный приток субстрата к ферментам и удаление продуктов реакции из зоны действия ферментов достигаются периодическим взбалтыванием реакционной смеси в процессе инкубации. Имеет значение частота встряхивания, которую устанавливают опытным путем при определении активности каждого фермента. Необходимо поддерживать одинаковую периодичность и энергичность встряхивания в процессе инкубации реакционной смеси.

Количественная экстракция продуктов реакции

. Одним из важных требований к методам почвенной энзимологии является полная экстракция из почвы продуктов ферментативной реакции, по количеству которых измеряют активность фермента. В качестве экстрагентов используют соответствующие буферные растворы, различные растворители. Измеряют количество экстрагированного компонента продуктов ферментативной реакции, который не адсорбируется или минимально адсорбируется почвой. Например, при определении фосфатазной активности лучше измерять количество органической части продуктов гидролиза фенилфосфата или фенолфталеинфосфата, используемых в качестве субстрата – фенола и фенолфталеина, так как ортофосфат активно связывается почвой и по ортофосфату можно получить заниженные показатели ативности.

Контрольные пробы.

В почве всегда присутствуют вещества, аналогичные продуктам распада большинства органических веществ, применяемых в качестве субстратов при почвенно-энзимологических исследованиях (глюкоза, аминокислоты, фосфор, аммоний и др.). Поэтому для корректировки результатов определения активности ферментов ставят следующие контрольные опыты.

1. Контроль на неферментативное превращение субстрата (контроль без фермента - К.б.ф.). Строго обязателен, особенно при определении активности окислительно-восстановительных ферментов, потому что в почве всегда присутствуют переменно-валентные катионы (Сu, Мn, Мо и др.), способные переносить электроны и осуществлять окислительно-восстановительные превращения. Обычно неферментативный гидролитический распад субстратов в почве незначителен или отсутствует. Для инактивации ферментов параллельные навески почв в реакционных сосудах стерилизуют сухим жаром при 180°С в течение 2-3 ч или автоклавируют при 2 атм. в течение 1 ч несколько раз. При этих условиях ферменты, иммобилизованные в почве, полностью инактивируются. Однако такие контроли нецелесообразны в тех случаях, когда продукты ферментативных реакций определяют фотометрическим методом или титрованием. Нагревание почвы при высокой температуре сильно изменяет её органическое вещество, оно становится растворимым и окрашивает фильтраты. Вместо жёсткой термической инактивации ферментов часто используют специфические химические ингибиторы: соли тяжёлых металлов, цианиды и др. В стерилизованную сухим жаром или обработанную ингибитором почву вносят антисептик, буферный раствор, субстрат и дальше проводят те же самые операции, что и с опытными пробами. В случае применения ингибитора фермента после инкубации в опытные сосуды добавляют такое же количество ингибитора. Могут быть использованы и другие эффективные способы инактивации ферментов при минимальном воздействии на почвенные свойства.

Интересное из раздела

Структура экологических систем
Существует образное выражение, что мы живем в эпоху трех «Э»: экономика, энергетика, экология. При этом экология как наука и образ мышления привлекает все более и более пристальное вни­м ...

Контроль за использованием и утилизацией отходов
Проблема использования отходов имеет не только экологический, но и экономический аспект. При наличии соответствующего механизма управления отходами последние могут стать одним из факторов п ...

Экологические проблемы атмосферы Кислые осадки Проблема озонового слоя в атмосфере Понятие о парниковом эффекте
Хозяйственная деятельность человечества в течение последнего столетия привела к серьезному загрязнению нашей планеты разнообразными отходами производства. Воздушный бассейн, воды и почва в ...